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4. Développement d’outils

Outils
© INRA
Au sein de l'équipe nous avons développé de nombreux outils pour analyser les effets des mycotoxines chez le porc : PCR quantitative et puce ADN pour analyser l'expression des gènes de la réponse immunitaire, explants intestinaux, intoxications expérimentales, mise en culture et isolement de différent types cellulaires porcins.

Au sein de l'équipe nous avons développé de nombreux outils pour analyser les effets des mycotoxines chez le porc : PCR quantitative et puce ADN pour analyser l'expression des gènes de la réponse immunitaire, explants intestinaux, intoxications expérimentales, mise en culture et isolement de différent types cellulaires porcins.

Développement des méthodes de PCR quantitative dans le but d’analyser l’expression des gènes impliqués dans la réponse immunitaire chez le porc
La principale limite à l'étude de l'expression des gènes dans l'espèce porcine est le manque de réactifs pour l'analyse des protéines. Les connaissances sur le génome porcin permettent de concevoir des amorces pour l'étude de l'expression des ARNm. La qPCR est une technologie largement utilisée qui combine l'amplification de l'ADN avec la détection immédiate des produits. Nous avons développé une approche qPCR utilisant le SYBR®Green pour quantifier la quantité initiale d'ARNm cible présente dans des échantillons obtenus à partir de tissus ou de cellules exposés aux toxines. Nous nous concentrons sur les gènes liés au système immunitaire comme les cytokines et les gènes de régulation ou des gènes liés à la structure de l'intestin. Les amorces sont obtenues à partir de nos recherches propres ou de la bibliographie. Environ 60 jeux d'amorces ont été validés pour l'étude de l'expression des gènes ou des cellules immunitaires intestinales. Nous avons appliqué cette technologie évaluer l'effet de l'exposition aux mycotoxines des cellules immunitaires ou de l'intestin (Meissonnier et al., 2008) ainsi que les effets des additifs alimentaires (Le Gall et al., 2009).

Développement d’une puce ADN spécifique pour la réponse immunitaire du porc
En collaboration avec C. Rogel-Gaillard (INRA, UMR GABI, Jouy-en Josas), nous avons développé une puce à ADN spécifique pour la réponse immunitaire du porc. Cette puce, constituée d longs oligonucléotides, combine un ensemble générique de 13297 sondes avec de nouvelles sondes cibleés sur la réponse immunitaire et le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Cet ensemble comprend 3773 sondes, qui visent tous les loci annotés du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH ainsi que des gènes de l'immunité en dehors de ce complexe . Cette puce ADN a été validée par l'étude de la réponse immunitaire des cellules mononucléées du porc issues du sang périphérique stimulés par le lipopolysaccharide (LPS) ou un mélange d'acétate myristate de phorbol (PMA) et de l'ionomycine (Gao et al., 2010). Nous utilisons actuellement cette puce pour étudier l'effet des mycotoxines sur la réponse immunitaire chez le porc.

Développement d’explants intestinaux comme technique alternative à investigation des effets des mycotoxines sur l’intestin
Dans le contexte de la réduction du nombre d'animaux de laboratoire (principes des 3R), les explants intestinaux représentent un modèle intéressant. La culture des explants intestinaux permet de préserver la structure histologique normale in vitro. En outre, un grand nombre d'explants peuvent être préparés à partir d'un seul animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaire pour une étude donnée. Dans ce contexte, nous développons un modèle d'explants jéjunaux que nous avons utilisé pour étudier l'effet des mycotoxines sur intestin de porc (Kolf-Clauw et al., 2009).

Développement of d’intoxications expérimentales
Notre animalerie nous permet d'effectuer des expériences in vivo (maximum 40 porcelets). Cette installation a reçu l'accord des autorités vétérinaires Et les personnes impliquées dans l'expérimentation animale ont le diplôme autorisant l'expérimentation d’animaux vivants. Nous effectuons des intoxications expérimentales, soit en utilisant des aliments contaminés artificiellement ou naturellement , soit un gavant les animaux. Selon l'objectif de nos études, des expositions à court et à long terme (de 1 semaine à 7 semaines) peuvent être envisagées.
Nous avons principalement axé nos études sur les effets des mycotoxines au niveau systémique en utilisant des échantillons de sang prélevés à la veine jugulaire. Nous travaillons également avec des échantillons d'organes, en particulier des échantillons intestinaux. Ces échantillons, prélevés lors de l’abatage sont immédiatement congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à leur traitement, ou préservés dans le formol.

Les paramètres systémiques mesurés comprennent les paramètres généraux toxicologiques (performance, hématologie/biochimie, histologie), ainsi que les paramètres spécifiques décrivant les réactions du système immunitaire. Nous avons porté une attention particulière sur l'impact des mycotoxines sur la réponse immunitaire spécifique suite à un challenge antigénique. En effet, la vaccination ou les modèles pathogènes ont déjà été utilisés pour évaluer les effets sur la mise en place de la réponse spécifique, humorale et cellulaire. (Pinton et al., 2008, Meissonnier et al., 2008).
Les paramètres intestinaux englobent une analyse histopathologique (immunohistochimie, histologie, les mesures de la crypte et les villosités), évaluation de la perméabilité intestinale (protéines de jonction, voies de signalisation cellulaire) et l'analyse de l'immunité intestinale (colonisation des bactéries, expression des cytokines) (Grenier et al., 2010).

Développement de culture cellulaire pour l’analyse des mécanismes d’action des mycotoxines
Dans le but d'identifier le mode d'action des mycotoxines, nous avons développé des techniques pour isoler et/ou différencier des cellules porcines. Les membres de l'équipe maîtrisent l'isolement de cellules sanguines, comme les lymphocytes, les neutrophiles ou les monocytes (Marin et al, 2007;. Yerle-Boissou et al, 2009). Nous travaillons également sur les macrophages alvéolaires porcins et les cellules dendritiques (Guzylack-Piriou, 2006). Pour les cellules épithéliales intestinales, nous utilisons la lignée porcine de cellules épithéliales intestinales IPEC-1. Cette lignée cellulaire est capable de se différencier lorsqu'elle est cultivée sur les semi-filtre poreux (Bouhet et al., 2004; Pinton et al, 2010).